Uso de la citometría de flujo para estudios epigenéticos

Los mecanismos epigenéticos prominentes incluyen la metilación del ADN y las modificaciones de histonas que alteran la accesibilidad a la maquinaria de transcripción. Este campo tiene una amplia gama de aplicaciones para su uso en investigación del cáncer, neurociencias, biología del desarrollo y más.

Punto de encuentro entre Epigenética y Citometría de Flujo

El dogma central de la biología molecular se basa en el hecho de que el ADN se convierte a ARN y este se es convertido a proteínas. Sin embargo, este principio ha quedado cada vez más anticuado desde que fue introducido a mediados del siglo XX. Los mecanismos relativos a la regulación de la expresión génica, el procesamiento del ARN y su traducción han revelado una imagen mucho más compleja acerca de cómo se producen y regulan las proteínas. Uno de los principales mecanismos de regulación genética es la epigenética, que estudia los factores que no implican alteraciones de la base del ADN. Los mecanismos epigenéticos prominentes incluyen la metilación del ADN y las modificaciones de histonas que alteran la accesibilidad a la maquinaria de transcripción. El estudio de los mecanismos epigenéticos tiene una amplia gama de aplicaciones en cáncer, neurociencias o la biología del desarrollo.

La aplicación de conocimientos epigenéticos a la inmunología ha resultado compleja. Las aplicaciones estándar como ChIP y Western blot proporcionan información sesgada acerca del comportamiento individual de cada célula en una muestra. Debido a su capacidad para analizar células de forma individual, la citometría de flujo ha demostrado ser un recurso invaluable para comprender el sistema hematopoyético, pero el estudio de la huella epigenética junto con los marcadores celulares requiere una consideración cuidadosa y una planificación experimental.

Consideraciones experimentales sobre el uso de la citometría de flujo con huellas epigenéticas

La primera consideración a tener en cuenta es la de disponer de un conjugado que tenga una señal suficientemente fuerte como para superar la baja abundancia de huellas epigenéticas con respecto a los marcadores tradicionales de superficie celular. En este caso, la ficoeritrina (PE) es una opción popular debido a su intensidad de señal. Por otro lado, el tulio-169 se recomienda para aplicaciones de citometría de masas. Otra limitación a tener en cuenta es la compatibilidad de los anticuerpos marcadores de superficie celular con los agentes permeabilizantes necesarios para poder acceder al núcleo. En este caso, el metanol puede dañar los epítopos, por lo que todos los anticuerpos deben revisarse dos veces antes del experimento. También se recomienda el uso de códigos de barras para evitar eventos de doblete. Por último, se necesitan controles internos para el contenido total de histonas utilizando un anticuerpo pan-histona para una cuantificación adecuada.

Validación de los reactivos para epigenética

Un desafío para la citometría de flujo epigenética es encontrar anticuerpos que no solo sean específicos para evaluar las marcas epigenéticas, sino que también sean adecuados para el propio flujo. La mejor manera de probar estos anticuerpos es mediante el uso de controles positivos y negativos mediante métodos farmacológicos o genéticos. La abundancia de marcas epigenéticas a veces se desencadena por estímulos específicos, como el daño del ADN, que puede proporcionar un método de validación adicional.

Aplicar este método a los estudios de inmunología

La citometría de flujo epigenética ya ha aportado conocimientos interesantes. Según se publica en la revista Cell, Cheung y colaboradores (PMID: 29706550) utilizaron este método para investigar los cambios epigenéticos sobre el envejecimiento. Antes de este estudio, se desconocía cómo el envejecimiento afectaba el sistema hematopoyético, específicamente en el perfil epigenético de cada tipo de célula inmunitaria.

Usando la citometría de masas para analizar variantes y modificaciones de histonas en más de 20 tipos de células inmunes, encontraron que los individuos jóvenes tienen perfiles epigenéticos similares tanto desde el punto de vista de una célula a otra como de una persona a otra. Sin embargo, durante el envejecimiento, aumenta la heterogeneidad de una célula a otra y de una persona a otra. Resultados similares con muestras de gemelos humanos sugieren que la variabilidad se debe a efectos ambientales. Además, los tipos de células inmunes podrían predecirse únicamente mediante perfiles epigenéticos. En general, su trabajo demuestra el poder de combinar la citometría de flujo con la epigenética.

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