La correcta elección de los controles de isotipo es un aspecto importante a tener en cuenta en los experimentos de Citometría de flujo. Los anticuerpos control de isotipo no reconocen ninguna proteína presente en la célula diana pero conservan todas las características inespecíficas del anticuerpo usado en el experimento.

La finalidad de estos controles es:

• Confirmar la especificidad de unión del anticuerpo de interés
• Descartar la unión del anticuerpo al receptor Fc u otras interacciones inespecíficas del anticuerpo con proteínas intracelulares.

UTILIZACIÓN DE ISOTIPOS DE CONTROL EN ENSAYOS DE CITOMETRÍA DE FLUJO

MARCAJE DE SUPERFÍCIE

Los controles de isotipo sirven para optimizar el protocolo de tinción de superficie celular y ayudar a evaluar el nivel de marcaje de fondo inherente a los ensayos de unión anticuerpo-célula.

Las claves para tener éxito en el uso de los controles de isotipo son:

• El anticuerpo control de isotipo debe ser de la misma especie e isotipo que el anticuerpo del experimento.
• Cuando se utiliza un control de isotipo, se debe utilizar la misma concentración de anticuerpo (en µg) para el control y para el anticuerpo del experimento.

Ningún control de isotipo es perfecto para todos los anticuerpos. eBioscience intenta reducir al mínimo las inconsistencias mediante el diseño de anticuerpos control de isotipo conjugados con un rango estándar de fluoróforo:proteína (relación F/P) similar a sus anticuerpos primarios.

Conclusión: Se recomienda el uso de los controles de isotipo en caso de realizar un marcaje de superficie.

Marcaje intracelular

Al realizar un experimento y comparar la intensidad de fluorescencia del control sin marcaje con la del control de isotipo se espera obtener un nivel bajo de tinción con este último. En el caso de una tinción intracelular es frecuente obtener niveles altos de fluorescencia inespecífica con el control isotipo. Esto es debido a que los anticuerpos control de isotipo se optimizan como controles para la tinción de superficie celular. Existen varias razones para que la tinción sea inconsistente como diferencias  en la composición de aminoácidos de los dos anticuerpos o diferente cantidad de fluoróforo conjugado en el isotipo control y el anticuerpo del experimento (diferente F/P). La activación de las células también puede alterar los patrones de tinción del control de isotipo. Por lo tanto, cuando se realiza un marcaje intracelular se recomienda usar como control negativo células no estimuladas o una población intrínsecamente negativa en una preparación de células heterogénea que se haya incubado con el anticuerpo de interés.

Conclusión: se recomienda el uso de controles de isotipo junto con controles negativos adicionales.