5 pasos para tener éxito en citometría de flujo intracelular

La capacidad de marcar y detectar moléculas intracelulares abre la puerta para poder identificar subconjuntos de células distintas y caracterizar aún más las poblaciones de células. Muchos tipos de células pueden identificarse así a través de sus patrones de citometría de flujo intracelular. En esta entrada de blog, te explicamos cinco puntos fundamentales para ahorrar tiempo y esfuerzo y aumentar su eficiencia al diseñar sus experimentos de citometría de flujo.

• Determinar el marcador intracelular
• Determina que marcador nuclear te conviene más utilizar
• Selección del tampón de marcaje intracelular
• Citometría de flujo para el estudio de señalización celular
• Añade a tu flujo de trabajo las bolitas de compensación UltraComp™ eBeads 

Determinar el marcador intracelular

El marcaje de proteínas en el interior de la célula requiere: (1) la fijación previa para provocar que las proteínas se entrecrucen y se estabilice la membrana celular y, (2) la permeabilización celular para que los anticuerpos puedan tener acceso a los componentes intracelulares. Estos tampones están diseñados para la detección óptima de proteínas citoplasmáticas y aquellas que deben ser secretadas y que se hayan en orgánulos celulares y/o vesículas, como son las citoquinas o las quimioquinas.

Debido a que las proteínas que se secretan se expresan a niveles muy bajos en las células que están en reposo, la expresión y la secreción deben ser procesos inducidos y bloqueados de manera controlada. Mientras el PMA (Phorbol-12-myristate 13-acetate) y la Ionomicina (calcio ionóforo) son agentes habitualmente utilizados para inducir la producción de citoquinas. Por otro lado, para una estimulación más específica y célula-dependiente, anticuerpos agonistas contra receptores celulares, como los CD3 y los CD28 para linfocitos T, son una muy buena opción.

Una vez las proteínas se expresan, es necesario que se bloqueen las vías secretoras con el fin de acumular la proteína de interés. Habitualmente, este procedimiento se consigue mediante Brefeldina A, que bloquea el transporte a nivel de retículo endoplasmático, o bien podemos utilizar Monensina que bloquea el transporte a nivel del aparato de Golgi. Consulta el catálogo de eBioscience en relación a los cocktails para estimulación celular en formato ready-to-use:

Gracias a estas características, el amplio portfolio de productos eBioscience se pueden encontrar anticuerpos para sacarle el máximo partido a nuestro experimento.

Determina que marcador nuclear te conviene más utilizar

Los factores de transcripción son proteínas que se unen al DNA y regulan la expresión génica, modulando la síntesis de RNA mensajero. Un mayor conocimiento de la expresión y regulación de la actividad de los factores de transcripción en las células del sistema inmunitario podría permitir descubrir nuevas oportunidades terapéuticas.

Selección del tampón de marcaje intracelular

Cuando realizamos un marcaje intracelular seguido de un análisis por citometría de flujo, la selección del los tampones de fijación y permeabilización son esenciales y tienen un gran impacto en la calidad y la precisión del resultado final.

Es por ello que es importante tener en cuenta la sub-localización celular de la proteína diana  a la hora de seleccionar el tampón adecuado. Por ejemplo, para obtener el mejor señal para el marcaje de un factor de transcripción, el Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set es el producto recomendado. Sin embargo, cuando se trata de proteínas secretadas como son las citoquinas o las quimioquinas, funciona mejor el Intracellular Fixation and Permeabilization Buffer Set.

En el momento en que deseamos marcar una proteína que se encuentra en diferentes compartimentos celulares, la elección del tampón es más complicada. Cada anticuerpo debe ser optimizado de forma independiente para validar su patrón de marcaje. El gráfico que tienes a la derecha proporciona las reglas básicas que debes seguir para escoger el tampón apropiado.

Citometría de flujo para el estudio de señalización celular

El análisis mediante citometría de flujo de las proteínas fosforiladas utilizando anticuerpos fosfo-específicos proporciona al investigador una manera efectiva de elucidar las cascadas de señalización en células de forma individualizada. El porfolio de eBioscience proporciona un amplio abanico de anticuerpo fosfo-específicos que han sido validados para ser testados en:

• Análisis marcadores específicos de vías de señalización.
• Análisis de marcaje célula-específico.
• Dependiendo de la aplicación: Western blot, ELISA o immunohistoquímica (IHC).
• Utilizando diferentes tipos de tampones intracelulares de fijación y de permeabilización.
• Reactividad cruzada entre ratón y humano.

LEFT: Western blotting of reduced lysates from Jurkat cells unstimulated left lane), stimulated with PMA and Ionomycin middle lane), or stimulated with PMA and Ionomycin in the presence of the MEK1/2 inhibitor, PD98059 right lane) using Anti-Human/Mouse phospho-ERK1/2 T202/Y204) Purified. RIGHT: Intracellular staining of Jurkat cells that were unstimulated black histogram), stimulated with PMA and Ionomycin green histogram), or stimulated with PMA and Ionomycin in the presence of the MEK1/2 inhibitor, PD98059 red histogram) with Anti-human/Mouse phospho-ERK1/2 T202/Y204 APC

Añade a tu flujo de trabajo las bolitas de compensación UltraComp™ eBeads

Staining of UltraComp eBeads with 13 different eFluor 450-conjugated monoclonal antibodies including one of each subclass commonly used in flow cytometry. Beads were stained with 0.25 ug of each antibody and analyzed by flow cytometry. Each histogram represents one staining antibody clone and isotype indicated at right)

Las UltraComp eBeads™ reaccionan con los anticuerpos de ratón, rata y hamster. Son immunoglobulinas de cadena ligera-independiente. Están diseñadas para ser utilizadas para la compensación de todos los fluorocromos que se excitan mediante lasers que emiten en el ultravioleta (355 nm) violeta (405 nm), azul (488 nm), verde (532 nm), amarillo-verde (561 nm), y rojo (633-640 nm). Las bolitas son partículas esféricas que pueden ser marcadas con anticuerpos conjugados comn fluorocromos de forma individualizada con el fin de ser utilizados como control de compensación para cada color.

Cada gota de estas bolitas contiene dos tipos de población: una población positiva que se encarga de capturar cualquier anticuerpo de origen murino (ratón, rata o hamster) y una población negativa que no reacciona con ningún anticuerpo. En el momento en que se añade un anticuerpo conjugado con un fluorocromo a las bolitas de compensación, se originan ambas poblaciones. Esta distribución bimodal se puede utilizar para la compensación de color para cada fluorocromo en experimentos de citometría de flujo multicolor.

¿Tienes dudas?

Si no te queda claro del todo cómo funciona esta tecnología, o quieres que te ayudemos a configurar tu ensayo, nuestro departamento técnico de especialistas, con amplia trayectoria en investigación (todos PhD), te pueden echar una mano: por mail (tecnic@labclinics.com), por tlf +34.934464700 o de forma presencial. Contáctanos y estaremos encantados de poder ayudarte!