Son muchos los investigadores que tienen en mente realizar un inmunoensayo tipo ELISA, pero cuando nos enfrentamos a ello por primera vez, siempre surgen las mismas dudas. En esta entrada de blog os queremos mostrar las preguntas más frecuentes sobre kits ELISA y su correspondiente solución. Sigue leyendo para obtener más detalles al respecto.
- ¿Cómo deben almacenarse los kits de ELISA?
- ¿Los reactivos vienen listos para ser utilizados?
- ¿Hay que tener algo en cuenta a la hora de incubar las muestras?
- ¿Cómo obtener los resultados?
- Mis resultados están fuera de la curva. Y ¿ahora qué hago?
¿Cómo deben almacenarse los kits de ELISA?
En general, esta norma sirve para cualquier material que recibamos en nuestro laboratorio. Cada kit de ELISA contendrá las especificaciones de almacenamiento necesarias que debemos tener en cuenta para almacenar un producto. En general, los productos de un kit de ELISA se suelen conservar a 4ºC o bien congelados a -20ºC.
Incluso en algunos casos, puede ser que diferentes componentes de un kit tengan temperaturas de conservación diferentes. Normalmente esta información suele ser visible fácilmente en el propio vial, tal y como se muestra en la imagen.
¿Los reactivos vienen listos para ser utilizados?
Habitualmente la respuesta a esta pregunta es no. Además, por lo general antes de sentarte en tu poyata antes de empezar el protocolo, debes dejar atemperar los componentes al menos durante 10 minutos, ya que las reacciones de afinidad de los anticuerpos se llevan a cabo a temperatura ambiente.
Es frecuente que los reactivos deban ser diluidos en un tampón especifico suministrado en el kit, es importante que midas la cantidad de reactivo necesario ya que no es extraño que se suministre más volumen del que se requiere.
¿Hay que tener algo en cuenta a la hora de incubar las muestras?
Es necesario utilizar una selladora de placas (la cual debe ser nueva) para asegurar que no se evapora contenido de la placa ni existe contaminación entre pocillos adjacentes. Acto seguido, deberás eliminar el contenido de cada pocillo y lavar la placa para eliminar el exceso de anticuerpo primario que no se ha unido de forma específica. Para realizar esta tarea, es recomendable que utilices una pipeta multicanal. En caso de disponer de un lavador de ELISA, asegúrate que éste está limpio. Golpea suavemente la placa sobre papel de filtro para secar completamente la placa.
¿Cómo obtener los resultados?
Una vez finalizado el protocolo y habiendo añadido la solución de parada, es importante no demorar la lectura, ya que los precipitados que se forman pueden interferir en la lectura. Es momento de dirigirnos al lector. Te recomiendo que previamente tengas los ajustes de lectura (dimensiones de la placa, emisor, detector, etc.) ya configurados, ya que puede ocasionar que la lectura de la placa se retrase.
Mis resultados están fuera de la curva. Y ¿ahora qué hago?
Los resultados que están fuera de la curva (recta patrón) no están respaldados. Es decir, no los podemos dar por válidos. Tan solo aquellos que estén dentro de la recta los podemos considerar verdaderos y reproducibles. La solución a este hecho será repetir el experimento pero en este caso, diluyendo la muestra al rango de detección que ofrece el kit.
Por el contrario, podemos estar frente a una situación totalmente opuesta. Es decir, que prácticamente no obtengamos señal. En ese caso, debemos tener en cuenta qué nuestra proteína diana se expresa en ese tipo de muestra. En algunos kits, es posible aumentar el volumen de muestra, en otros casos es necesario recurrir a ensayos de ELISA con mayor sensibilidad. Un factor a tener en cuenta y que puede ser de gran ayuda es el uso de un control positivo, ya que eso nos asegurará que estamos trabajando dentro del rango de detección.
Este es un cuadro resumen de los principales problemas, causas y soluciones que podemos encontrar a la hora de realizar la técnica de ELISA.
Problema | Causa | Solución |
---|---|---|
Problemas con el anticuerpo/epítopo | El anticuerpo de captura no se unió a la placa | Aumenta el tiempo de incubación del anticuerpo de captura |
Utiliza los componentes a una concentración superior | ||
Utiliza coated ELISA kits | ||
El epítopo impide la unión a la placa | Conjuga la proteína diana antes de unir a la placa | |
La concentración del anticuerpo primario es muy baja | Aumenta la concentración del anticuerpo primario | |
Aumenta el periodo de incubación | ||
Pérdida de la capacidad de unión debido a un almacenamiento erróneo | Almacena los anticuerpos a -20ºC | |
Evita realizar ciclos de congelación-descongelación | ||
Actividad insuficiente del reportero | Está presente un inhibidor enzimático | Evita el uso de Azida sódica en las reaccioness en que esté presente la peroxidasa |
Evita la presencia de fosfato en reacciones de fosfatasa alcalina | ||
El reactivo de detección está caducado, contaminado o su pH no es el adecuado | Utiliza un sustrato recién preparado y a un pH correcto | |
El sustrato de detección está muy diluido | Aumenta la concentración del sustrato de detección | |
La temperatura de incubación es errónea | Optimiza la temperatura de incubación | |
Asegúrate que todos los componentes se encuentran a temperatura ambiente antes de iniciar el protocolo | ||
Error en la placa | Demasiado lavado | Calibra la presión del lavador automático |
Utiliza una pipeta manual | ||
Los pocillos están secos | Cubre la placa con film de sellado durante las incubaciones | |
El fondo de los pocillos ha sido rallado por punta de pipeta | Ten cuidado mientras dispensas los reactivos en la placa |
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