Todas las técnicas basadas en el reconocimiento de antígenos dependen del uso de anticuerpos sensibles y altamente específicos, sin embargo, la reactividad cruzada, la variabilidad entre lotes y el uso de anticuerpos en aplicaciones no testadas han causado efectos potencialmente devastadores en la investigación.
- 1) ¿Es el anticuerpo escogido el adecuado para esa aplicación?
- 2) Seleccionar la espécie huésped y la clonalidad
- 3) Escoge un anticuerpo secundario apropiado
- 4) Consulta la literatura
- 5) Estudia el datasheet del producto
- 6) Revisa tus protocolos para obtener resultados óptimos
- 7) Maneja el anticuerpo correctamente
- 8) Maneja el anticuerpo correctamente
1) ¿Es el anticuerpo escogido el adecuado para esa aplicación?
Nunca deberíamos suponer que un anticuerpo que funciona para una aplicación funcionará en todos los escenarios posibles. Por ejemplo, un anticuerpo puede reconocer un epítopo dentro de una sección de tejido congelado en un experimento de Inmunohistoquímica (IHC), de tal forma que este epítopo no será accesible en una muestra para Western blot que se ha reducido y desnaturalizado. El datasheet del producto, suministrado con el anticuerpo, debe detallar todas las aplicaciones en las que ha sido testado. Deben incluirse aquellas aplicaciones en las que ha producido el patrón esperado de tinción, junto con datos específicos del lote.
2) Seleccinar la especie huésped y la clonalidad
Es importante que la especie huésped del anticuerpo primario sea diferente a la especie de la muestra de prueba para evitar la reactividad cruzada de los anticuerpos secundarios con inmunoglobulinas endógenas presentes en la muestra. También es prudente tener en cuenta la clonalidad del anticuerpo primario. Los anticuerpos monoclonales son homogéneos, reconocen un único epítopo antigénico y se caracterizan por presentar un ruido de fondo bajo y resultados experimentales consistentes. Por lo tanto, la detección de antígenos procedentes de múltiples especies no es habitualmente posible. Por contra, los anticuerpos policlonales se unen a múltiples epítopos, proporcionando amplificación de señal y una mayor tolerancia a los cambios de antígeno, presentan mayor background y están sujetos a variabilidad entre lotes.
3) Escoge un anticuerpo secundario adecuado
Los anticuerpos secundarios, generados contra la especie huésped del anticuerpo primario, están disponibles en muchos formatos y deben seleccionarse de acuerdo con la aplicación. Ofrecen un método simple de amplificación de señal mediante la unión de múltiples secundarios a un solo anticuerpo primario. Los conjugados de anticuerpos primarios pueden aumentar la complejidad experimental, así como reducir el número de pasos dentro de un protocolo de inmunotinción; sin embargo, como con todos los anticuerpos, una validación rigurosa es esencial para garantizar que la reactividad cruzada no genere resultados engañosos.
4) Consulta la literatura
PubMed y CiteAb son excelentes recursos para descubrir qué anticuerpos están usando otros investigadores. También se puede extraer información valiosa sobre qué aplicaciones y condiciones experimentales han tenido éxito con un anticuerpo en particular.
5) Estudia el datasheet del producto
Además de proporcionar información sobre las aplicaciones en las que se ha validado un anticuerpo, las fichas de producto contienen muchos detalles adicionales. Esto generalmente incluye una descripción del inmunógeno, la naturaleza del epítopo (si se ha mapeado), la especie huésped, el isotipo del anticuerpo, la reactividad entre especies (ya sea probada o predicha en base a la homología de secuencia) y las diluciones iniciales recomendadas. Si un fabricante no ha evaluado un anticuerpo en una determinada aplicación, esto no significa que no funcionará. Condiciones como la dilución de anticuerpos, el tiempo de incubación o el tampón de dilución son parámetros que pueden modificarse para optimizar la señal.
6) Revisa tus protocolos para obtener resultados óptimos
Todos los protocolos de inmunotinción requieren una optimización cuidadosa. Factores a considerar incluyen: la naturaleza del tampón de bloqueo, el buffer en que se diluyen los anticuerpos, los tampones de lavado, la duración de los pasos de incubación y por supuesto, el método de detección. Mientras que algunos anticuerpos primarios producen una tinción clara después de una corta incubación a temperatura ambiente, otros funcionan mejor con una incubación durante toda la noche a 4°C. La preparación de la muestra también es importante, ya que algunos anticuerpos reconocen un epítopo en su estado nativo y otros se unen solo cuando la muestra ha sido desnaturalizada. Al estudiar los protocolos proporcionados por el fabricante, así como al investigar la literatura, se debe lograr el patrón deseado de tinción.
7) Maneja el anticuerpo correctamente
Consulte el datasheet del producto para determinar la mejor forma de reconstituir, almacenar y dividir en alícuotas el anticuerpo. Esta ficha técnica también revelará cualquier consideración especial, por ejemplo, indicando que los anticuerpos conjugados con fluoróforo siempre deben almacenarse e incubarse en la oscuridad.
8) Incluye siempre controles en tus experimentos
La interpretación de los datos depende de la inclusión de controles positivos y negativos. Los controles positivos pueden ser una proteína recombinante o bien un lisado preparado a partir de una línea celular que está demostrado que produce niveles detectables de la proteína diana. Los controles negativos pueden incluir muestras extraídas o lisados preparados a partir de células tratadas con ARN de interferencia. Utilizar controles internos es crucial para garantizar el resultado de un experimento. La omisión del anticuerpo primario permite evaluar el background atribuible al anticuerpo secundario, mientras que los controles de isotipo (anticuerpos que no reconocen la proteína diana, pero que comparten el mismo isotipo que el anticuerpo primario) pueden usarse para identificar el background que se debe al anticuerpo primario.
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