5 Trucos para realizar Inmunoprecipitación con éxito

El pull-down de proteínas es una tecnología ya bien establecida en los laboratorios. Este procedimiento puede ser difícil, particularmente cuando la proteína de interés se expresa a niveles bajos. En esta entrada de blog discutimos 5 consejos que le ayudarán a mejorar sus resultados de IP.

Problemas relacionados con la concentración de la proteína

En general, normalmente la concentración de la proteína de interés es desconocida cuando se realiza una inmunoprecipitación; sin embargo, el rendimiento de un IP depende de la concentración de esa proteína: cuanto mayor es la concentración de proteína, mayor es el rendimiento de IP. Estimamos que la concentración de proteína intracelular es aproximadamente de 1 nM para un nivel de expresión bajo, aproximadamente 50 nM para niveles de expresión de proteína endógena y aproximadamente 1000 nM para las proteínas altamente expresadas, respectivamente; todo ello depende del tipo de célula.

Problemas relacionados con la capacidad de unión

Es posible que un anticuerpo que sea específico reconociendo a una proteína, no funcione bien cuando inmunoprecipita esa proteína en concentraciones bajas. Asegúrese de que su anticuerpo tenga una constante de disociación baja KD porque los anticuerpos de baja afinidad se unen solo a una fracción de proteína muy pequeña. Cuanto mayor sea la afinidad de unión de la resina IP, mayor será el rendimiento de proteína. Por ejemplo: A una concentración de proteína de 50 nM, una resina IP de medio de baja afinidad con una KD de 150 nM se une solo al 25% de la proteína, mientras que una resina de alta afinidad con una KD de 1 nM se une a casi toda, es decir, al 98% de la proteína. La GFP-Trap de Chromotek tiene un KD notablemente baja de tan solo 1 pM (afinidad muy elevada) y, por lo tanto, permite pull-downs eficientes de concentraciones de proteína incluso bajas.

Problemas relacionados con el tiempo

El tiempo de lavado óptimo debe determinarse experimentalmente. Es necesario considerar la unión efectiva de la proteína de interés (para la Co-IP, la formación del complejo proteico), la degradación de la proteína a lo largo del tiempo y la eliminación del ruido de fondo mediante múltiples pasos de lavado. Utilice resinas IP de alta afinidad cuando el protocolo requiera múltiples lavados y prolongados. Sin embargo, el uso de resina IP con bajas tasas de disociación ayuda a evitar la lixiviación de la proteína unida. El uso de una resina IP con altas tasas de unión acorta los tiempos de incubación. Cuanto más corto sea el tiempo de lavado, mejor será el rendimiento del pull-down.

Problemas relacionados con la especificidad

Cuanto mejor sea la especificidad de la matriz, menor será el ruido de fondo. Utilice solo resinas IP altamente específicas, bien caracterizadas y validadas para obtener resultados fiables y reproducibles.

Problemas de volumen

Cuanto menor sea el volumen, más eficaz será su IP. El uso de volúmenes pequeños mantiene una concentración alta de proteínas y, por lo tanto, aumenta el rendimiento de unión. La concentración está en función del volumen. Intente utilizar un volumen lo más pequeño posible. Eso mantiene alta su concentración de proteínas y, por lo tanto, aumenta la eficiencia de unión.

En resumen, recomendamos tener en cuenta la concentración de proteínas, la afinidad de unión, el tiempo de procesamiento, la especificidad de la resina IP y el volumen de tampón al planificar su próxima inmunoprecipitación para obtener los mejores resultados de inmunoprecipitación.