Alternativa al RNA-seq: Expresión de ARN dirigida

La elaboración de perfiles de expresión de ARN de modelos biológicos para identificar qué genes se expresan y qué vías están activas en sistemas biológicos en diferentes condiciones es fundamental para desentrañar cómo los genes controlan la biología. Durante años, la qRT-PCR ha brindado un enfoque confiable y sólido para evaluar los niveles de transcripción de cualquier gen. Sin embargo, el ensayo qRT-PCR se limita a unos pocos objetivos. Se han desarrollado enfoques que utilizan arrays de sondas de oligonucleótidos para abordar esta limitación de rendimiento, pero el análisis de expresión de ARN con microarrays no proporciona mediciones sólidas de los niveles de expresión que ofrece la qRT-PCR. Además, la detección indirecta por fluorescencia de transcritos hibridados con oligonucleótidos ordenados tiene el problema del ruido de fondo y señales causadas por la hibridación cruzada.

Con la aparicion de la secuenciación de nueva generación (NGS) asequible y accesible, la secuenciación completa de ADNc elaborado a partir de ARN aislado de modelos biológicos de interés se volvió mucho más factible. Los enfoques de RNA-seq han superado a los microarrays como el método de elección para el análisis de expresión de todo el genoma.

Si bien proporciona una lectura precisa de los transcritos presentes en las muestras biológicas, también existen limitaciones del RNA-seq. Puede ser un ensayo difícil de realizar para un gran número de muestras. Además de la extracción del ARN, la preparación de muestras, especialmente para grupos interesados ​​principalmente en genes de expresión de proteínas, requiere enriquecimiento de ARNm. Para las muestras de sangre, se requiere trabajo adicional para disminuir los niveles del gen beta-globina. Incluso después de completar este trabajo preparatorio sobre el ARN, el ensayo implica la síntesis de ADNc del transcriptoma total, seguida de la generación de bibliotecas NGS a partir del complemento total de ADNc fragmentado. El análisis NGS de estas muestras complejas requiere una profundidad de secuenciación significativa (generalmente de 25 a 50 millones de lecturas), así como un procesamiento bioinformático y de convolución involucrado para estimar el número de copias de cada gen a partir de un gran número de lecturas de fragmentos de genes variables. Driver map ofrece una alternativa al RNA-seq.

Superando las limitaciones del RNA-seq – Secuenciación de ARN dirigida de todo el genoma para perfiles de expresión

Una alternativa a la secuenciación de todo el transcriptoma es utilizar un enfoque de secuenciación de ARN dirigido. Esta es la base del ensayo de expresión de ARN dirigido DriverMap desarrollado por Cellecta. En lugar de transcribir de forma inversa todo el transcriptoma, el método DriverMap combina la amplificación de RT-PCR multiplex para amplificar un segmento definido y conservado de 80 a 250 bases de la transcripción de cada gen objetivo, y luego utiliza la secuenciación mediante NGS para evaluar cuantitativamente los niveles de abundancia de cada uno de estos amplicones de transcripción.

Hay ventajas significativas en la focalización, amplificación y secuenciación de loci discretos cuidadosamente seleccionados de interés en el transcriptoma expresado. Desde una perspectiva de procedimiento, el uso de cebadores específicos de genes que se dirigen a cada gen de interés para la transcriptasa inversa y las reacciones de PCR elimina la necesidad de preparar ARN para eliminar secuencias no deseadas como ARN ribosómico, beta-globinas u otro ARN no codificante.

Solo se amplifican las secuencias de transcripción que coinciden con los objetivos de interés. Como resultado, solo se necesita el ARN total para el ensayo y, dado que se basa en PCR, el requerimiento es bajo. Tan solo 10 pg de ARN total del lisado de una sola célula es suficiente para detectar la mayoría de las transcripciones.

El enfoque dirigido de DriverMap RT-PCR también simplifica enormemente la biblioteca de ADNc que debe secuenciarse. Un ensayo multiplex que se dirige a los 19 000 genes humanos que codifican proteínas produce, como máximo, solo 19 000 amplicones para la secuenciación. La profundidad de lectura de NGS requerida para leer de manera confiable varios miles de amplicones específicos es mucho menor que la profundidad requerida para todo el transcriptoma. Como resultado, el enfoque dirigido detecta transcritos con menor nivel de expresión de manera más consistente y confiable que otros enfoques de RNA-seq y con mucha menos secuenciación.

Además de requerir menos lecturas en NGS, el análisis de los resultados es mucho más simple utilizando DriverMap, ya que cada región objetivo de ADNc proporciona una secuencia de referencia con la que comparar directamente las lecturas de secuenciación. No hay necesidad de estimar el número de copias del gen a partir de fragmentos de ADNc ensamblados. Con la RT-PCR dirigida, los niveles de lectura de cada amplicón se correlacionan directamente con los niveles de expresión del transcrito objetivo.

Desarrollo de los cebadores para el análisis dirigido de ARN: DriverMap

La clave del enfoque del ARN dirigido es la eficiencia y la especificidad del paso de amplificación del objetivo mediante la PCR multiplex. Numerosos factores que pueden tolerarse en las reacciones de PCR simples, como la unión no específica, la ineficacia de la unión del cebador y las interacciones cebador-cebador, pueden causar problemas significativos en un entorno de PCR multiplex, que amplifica muchos miles de secuencias en la misma reacción.

El desarrollo del ensayo DriverMap requirió un sofisticado trabajo de diseño de cebadores y un proceso de prueba empírico iterativo. Para ello, se desarrolló un pipeline de diseño de cebadores bioinformáticos y se llevó a cabo la validación experimental de miles de cebadores de PCR en una reacción multiplex de alta complejidad. Este enfoque permitió generar un ensayo de PCR multiplex optimizado en todo el genoma para los 19.000 genes codificadores de proteínas humanas. Inicialmente, los cebadores se seleccionaron y examinaron según varias características. Por ejemplo, todos los cebadores se seleccionan para tener secuencias ricas en GCA (con un contenido mínimo de T) para reducir la formación de dímeros de cebadores en el ensayo de PCR multiplex.

Además, los cebadores se seleccionan por su alta especificidad, alta Tm y un tamaño pequeño de amplicón con una distribución equilibrada de nucleótidos para garantizar una NGS robusta.

Además de la selección bioinformática, cada conjunto de cebadores también tuvo que probarse experimentalmente. Para cada ARNm objetivo, se sintetizaron los mejores 5–20 cebadores  y se ejecutaron en varias reacciones de RT-PCR multiplex usando un conjunto de ARN de línea celular/tejido humano de control universal, ARN de control negativo de ratón y controles positivos. Se seleccionó un conjunto de cebadores dirigidos a las porciones conservativas de diferentes isoformas de ARNm con la mayor eficiencia, sensibilidad y especificidad para cada ARNm. Además, para los transcritos muy abundantes, se seleccionaron cebadores con baja eficacia específica, lo que nos permitió resolver el problema de la sobresecuenciación de transcritos altamente expresados.

Si bien DriverMap Targeted RNA Profiling ofrece numerosos beneficios sobre la secuenciación de ARN estándar, no es un reemplazo para la aplicación más amplia RNA-seq. El ensayo DriverMap requiere el conocimiento de los transcritos de interés. Dado que la síntesis de cDNA y los cebadores de PCR se dirigen a regiones específicas en el RNA expresado de genes conocidos, no es un enfoque útil para identificar nuevos transcritos ni un buen enfoque para investigar isoformas alternativas de genes particulares. Además, el ensayo, tal como está configurado, se dirige a genes que codifican proteínas. No detectará ARN no codificante u otras transcripciones no dirigidas. Sin embargo, se pueden desarrollar ensayos personalizados para estos fines.

En general, proporciona un método conveniente y efectivo para identificar qué vías están activas en las muestras biológicas de interés. Como ensayo de PCR, es particularmente efectivo cuando las muestras son limitadas con cantidades muy pequeñas de ARN. Además, debido a la capacidad de dirigirse a conjuntos seleccionados de genes, puede ser especialmente útil para cuantificar células o biomarcadores expresados ​​en niveles muy bajos. También se pueden diseñar ensayos personalizados para apuntar específicamente a genes de interés de bajo nivel. En particular, para los investigadores interesados ​​en medir los niveles de transcripción de fracciones celulares específicas en muestras heterogéneas, como las células inmunitarias en muestras tumorales, esta capacidad para detectar genes de baja expresión puede ser crucial. Ofrecen paneles prediseñados para humanos y ratones, además de paneles personalizados.

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