Biología Molecular
Top 5 errores de principiante en qPCR y cómo evitarlos
En la entrada de este mes, te describimos los cinco errores de principiante a la hora de hacer una PCR cuantitativa (qPCR; quantitative PCR) y la mejor manera de evitarlos. Ya sea porque es la primera vez que realizas una qPCR o bien porque simplemente quieres asegurarte de maximizar tus posibilidades de éxito, aquí te mostramos algunas normas básicas que debes tener en cuenta.
- 1. Poca calidad del RNA
- 2. Escoger el tipo de detección
- 3. No utilizar una mastermix y no organizar tus experimentos
- 4. Escatimar en el número de controles
- 5. No validar tus resultados con un gen de referencia
1. Poca calidad del RNA
Este es posiblemente el paso más crítico para preparar de forma exitosa nuestro cDNA y poder realizar una qPCR eficiente y reproducible. El RNA es un material extremadamente sensible a la degradación por RNasas y debe manejarse con cuidado durante los pasos de aislamiento de ácidos nucleicos.
El RNA degradado o contaminado puede afectar negativamente la eficiencia y rendimiento de nuestra RT-qPCR. Pipetas, puntas o incluso la propia poyata del laboratorio, pueden ser foco de RNAsas y deben estar extremadamente limpio para utilizarlos con el propósito de aislar RNA.
Una vez extraído nuestro RNA, debemos evaluar su pureza. Una opción es determinarlo mediante espectrofotometría. Además de la concentración, nos debemos fijar en la relación de absorbancia entre 260 y 280 nm (A260/A280). Esta relación debe estar en el rango de 1.8-2.0. Si es inferior, puede sugerir la contaminación de la muestra por fenol o proteínas.
2. Escoger el tipo de detección
Cada PCR en tiempo real contiene una molécula indicadora de fluorescencia, bien sea una sonda (tipo Taqman®, Molecular Beacons o Scorpions™ Probes). A medida que aumenta la cantidad de amplicón deseado, también lo hace la cantidad de fluorescencia emitida por el fluoróforo.
Existen dos tipos de ensayo para realizar estudios de expresión génica mediante PCR en tiempo real:
- Ensayos basados en sondas Taqman® (también llamados ensayos del tipo nucleasa 5′ fluorogénico)
- Ensayos basados en SYBR® Green dye.
En el siguiente cuadro te indicamos en qué situación es mejor utilizar uno o el otro.
Cada tipo de ensayo tiene sus ventajas y limitaciones. Por ejemplo, la tecnología basada en sondas permite realizar PCR multiplex. Sin embargo, si tu prioridad es obtener una alta sensibilidad, la tecnología basada en green dyes puede ser la más adecuada. En este cuadro, te mostramos las ventajas y desventajas de cada uno de los sistemas.
3. No utilizar una mastermix y no organizar tus experimentos
El uso de una mastermix minimiza la variabilidad experimental y, por lo tanto, mejora la reproducibilidad al reducir las variaciones pocillo a pocillo y de muestra a muestra. Del mismo modo, es fundamental mantenerse organizado en el diseño y la ejecución de nuestros experimentos de qPCR. Por ejemplo, es útil realizar una tabla que incluya los primers y las muestras para saber qué va y a dónde va. No hay nada peor que distraerse y olvidarse de qué pocillo tiene y no ha sido pipeteado. Algunos investigadores eligen su diseño en un patrón, por ejemplo los primers ordenados alfabéticamente.
De esta manera, al cargar la muestra se pueden hacer coincidir las puntas con los pocillos a la manera del juego “Hundir la Flota” (es decir, punta C7 a C7, etc…). No importa la estrategia de pipeteo, pero no te olvides de hacer un spin a tu placa antes de meterla en el termociclador para evitar que cualquier líquido quede en las paredes de los pocillos.
4. Escatimar en el número de controles
Es importante incluir los controles apropiados en la configuración de nuestros experimentos de RT-qPCR. Estos, deben incluir un control negativo que no contenga RNA o cDNA y reemplazar el volumen con agua (libre de nucleasas), es el denominado “control sin muestra“. Este control, permite detectar contaminación cruzada de superficies o reactivos (es decir, problemas de contaminación en mastermix o primers) así como la formación de primer-dimers. Por lo tanto, si observas amplificación en este pocillo, deberías correr un gel de agarosa para averiguar de qué se trata. Otro control negativo es el siguiente: una muestra negativa a la cual no se le ha añadido la retro-transcriptasa inversa, de tal forma que no se ha formado el cDNA. Si se detecta producto, este resultado sugiere contaminación de la muestra por DNA exógeno.
5. No validar los resultados mediante un gen de referencia
La amplificación de un gen control (o de referencia) permite la normalización de la expresión del gen diana mediante la comparación de los valores de Ct. Muchas veces, esto puede explicar las diferencias en la cantidad o calidad del material de partida (RNA o cDNA), así como las diferencias en los métodos de preparación de RNA o la síntesis de cDNA. Un gen de referencia veraz es aquel cuyo nivel de expresión no se ve afectado por sus variables o intervenciones experimentales y además no difiere entre los estados fisiológicos relevantes de sus condiciones de muestra.
¿Tienes dudas?
Si no te queda claro del todo cómo funciona esta tecnología, o quieres que te ayudemos a configurar tu ensayo, nuestro departamento técnico de especialistas, con amplia trayectoria en investigación (todos PhD), te pueden echar una mano: por mail (tecnic@labclinics.com), por tlf +34.934464700 o de forma presencial. Contáctanos y estaremos encantados de poder ayudarte!
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14 Comments
isabel
Buenos días,
Estoy estudiando mciroRNA en tejido cardiaco de rata. Y hoy al repetir en una PCR unas muestras que me funcionaban perfectamente he visto que han salido en ciclos supertardíos, ¿eso a qué se debe? ¿degradación? ¿creen que debo volver a cuantificar los microRNAs, hacer la RT sobre esos valores y repetirla?
Quizás sea una tontería de pregunta, pero si pudiesen ayudarme con qué es lo que suele fallar cuando la amplificación está entorno a los ciclos treinta y tantos…
Muchas gracias de antemano,
Labclinics
Buenos días Isabel,
Muchas gracias por ponerte en contacto con nosotros y por leer nuestras entradas de blog. En primer lugar, te recomiendo que intentes amplificar tu housekeeping gene si es que no lo has hecho. Ello, nos va a indicar si existe un problema en las condiciones de PCR o bien si nuestro material de partida está afectado.
Si la qPCR para nuestro housekeeping gene no funciona como es debido, es probable que tengamos un problema en nuestro cDNA. A pesar que el cDNA es mucho más estable (y puede ser almacenado durante periodos prolongados de tiempo a -20ºC). Para testar la calidad de tu cDNA, puede ser recomendable hacer una PCR con primers flanqueando un intrón de un gen cualquiera. Es decir, un Fwd primer en Exon 1 y el Rv primer en el Exon 2. De tal forma que esto nos va a permitir descartar que no existe contaminación por DNA genómico (el tamaño de la banda diferirá debido al tamaño de la región intrónica).
Por otro lado, si nuestro housekeeping gene funciona correctamente, el material de partida tiene una calidad aceptable y por lo tanto existe un problema en nuestra PCR en la cual deberemos hacer troubleshooting. Algunos tipsa seguir pueden ser:
1. Re-diluir nuestros sets de primers para asegurarnos que tenemos en nuestra mastermix ambos Fwd y Rev primers.
2. Chequear que todos nuestros reactivos que componen la mastermix.
3. Es extraño, pero asegúrate que no tenemos ningún inhibidor de PCR en nuestra reacción. Por ejemplo, si eluyes tu RNA en tampón TE o AE, que contienen EDTA, ello inhibirá la PCR.
4. Si todo parece correcto, pero aún así sigue sin funcionar, comprueba el termociclador. Comprueba que la temperatura es la correcta (no solo en los Settings..)
5. Si es posible, te recomiendo que vuelvas a iniciar el protocolo desde el inicio, generando un nuevo material de partida (RNA).
Espero que estos trucos sirvan de algo,
¡Mucha suerte!
Soporte Técnico de Labclinics S.A.
María Álvarez
Hola, buenos días.
Estoy estudiando expresión de citoquinas en tejido intestinal de ratón.
Hace poco descatalogaron el Kit que empleábamos para la extracción de RNA, que posteriormente transcribimos a cDNA, y nos ha tocado utilizar un nuevo kit de extracción de RNA. La misma casa comercial con la que trabajábamos nos recomendó un kit que nos ha dado muy malos resultados ya que las columnas de RNA se nos colapsaban. Después de esto, hemos probado con otros 2 kit de casas comerciales diferentes con los que sí logramos recuperar la cantidad final esperada pero cuando realizamos qPCR obtenemos un ciclo de actina (housekeeping) más alto del que obteníamos cuando utilizábamos el kit que ya está descatalogado. El ciclo de actina anteriormente nos amplificaba en torno al Ct 15-20 y ahora estamos en unos valores Ct de 21-27. Por tanto, como la actina sale a un ciclo tan elevado, al estudiar la expresión de citoquinas los valores nos salen indeterminados.
Mediante Nanocrob hemos medido la puereza del cDNA extraído y los valores obtenidos a una absorbancia 260/280 se encuentran dentro del rango óptimo 1.8-2. Además, estas muestras las conservamos a -80ºC, por lo que no debe ser por problemas de degradación.
El protocolo de extracción de RNA, según el fabricante se lleva a cabo a temperatura ambiente. Una vez obtenida la porción de intestino para extraer, la machacamos en trocitos con tijera dentro de un ependorf que lleva el buffer de lisis con b-mercaptoetanol. Esta solución la mantenemos en agitación a temperatura ambiente unas 3 horas para mayor degradación del tejido y después continuamos con el protocolo hasta la obtención de RNA.
¿ Qué creen que puede estar pasando? ¿ qué variante podrá probar para descartar posibles problemas?
Muchas gracias de antemano.
Labclinics
Buenos días María,
En primer lugar, muchas gracias por leernos y por compartir tus dudas con nosotros.
Una buena solución para extraer RNA con buena cantidad (y calidad) es la combinación del uso de Trizol y la transferencia de la fase acuosa a una columna de purificación de RNA.
Además de la determinación mediante lectura de absorbancia con Nanodrop, podéis intentar correr una pequeña cantidad de RNA en un gel de agarosa, para descartar que las dos bandas que se obtienen, estén degradadas.
Por otro lado, tampoco se debería descartar que exista algún problema en la producción de cDNA ya que el control interno amplifica a un ciclo un tanto tardío.
En nuestro catálogo disponemos de columnas de purificación, kits de cDNA y mastermixes para SYBR Green o bien el uso de sondas Taqman.
Nos ponemos en contacto contigo para facilitarte más detalles.
Un saludo
Soporte Técnico de Labclinics S.A.
Carmen
Buenas tardes,
Necesitamos estudiar expresión de 5 genes y un número alto de muestras. Es necesario incluir el gen de referencia en todas las placas para poder compararlo con los genes de estudio? O podemos hacerlo de la siguiente manera: placa 1 (2 genes de estudio), placa 2 (2 genes de estudio) y placa 3 (1 gen estudio+ gen de referencia).
Muchas gracias!
Labclinics
Buenos días Carmen,
En primer lugar, muchas gracias por leer nuestras entradas de blog. Esperamos que te sean útiles en tu trabajo diario.
Si necesitas estudiar tantas muestras y expresiones de diferentes genes, antes de empezar, te recomiendo realizar una qPCR para testar que la calidad de tu cDNA. Puedes utilizar diferentes house-keeping genes como GAPDH, B2M, 18S, etc. Niveles bajos en tus Cq indicarán cual es el mejor housekeeping que se adapta a tus necesidades.
Te recomiendo analizar las muestras por triplicado y para reducir los errores por pipeteo, recomiendo preparar una master mix para cada gen.
La mastermix sería:
– 10 ul master mix (2X)
– 1 ul de sonda (20X) o bien 1 uL de sonda Sybr Green (20x) sin primers: 0,6 uL F + 0,6 uL R.
– 1 uL cDNA (35 ng)
– H2O hasta un volumen final de 20 uL.
En mi opinión, analizaría los 5 marcadores de interés más el gen housekeeping simultáneamente en el número de muestras que sea posible. No es un problema que el housekeeping no esté dispuesto en la misma placa, pero sí en el mismo ensayo. Es decir, no analizaría el gen control en un experimento por separado. Siempre, cada marcador con el control. Por ello, si por cuestiones de disponibilidad no es posible, es mejor analizar menos muestras pero más marcadores simultaneamente.
Un saludo
Soporte Técnico de Labclinics S.A.
catalina
hola,
estoy desesperada.
Antes de hacer el cDNA verifico la integridad y la pureza ( ambos me dan super bien), pero hay algo entre el cDNA y el qPCR que falla.
Uso como housekeeping Actina, y evaluo 3 genes ( Hps70, MBP y Haptoglobina). Mi problema es que el housekeeping amplifica tardiamente ( pasado el ciclo 30).
A que puede deberse que el housekeeping no me de ?
Laura
Buenas tardes,
Estoy realizando un experimento con glándula salival de ratón y en la RT-qPCR me salen Ct en algunos casos muy tardíos (Ct33/34), ¿hasta que punto son fiables estos ciclos o donde llegaría el límite de ciclos que pueda fiarme?
En este tejido el housekeeping también me sale más tardío comparado con otro tipo de tejido cerebral, aunque en este caso, concentrándolo más que en otros tejidos estaría en ciclos en torno a Ct28.
¿En este caso debería hacer un volumen de reacción de 20ul en vez de 15ul?
Gracias de antemano
Labclinics
Hola Laura,
Muchas gracias por ponerte en contacto con Labclinics. ¿Qué gen de referencia estáis utilizando? Si está muy expresado, como es el caso en ActinB, Gapdh o 18S, realmente parece un problema en la preparación del cDNA, ya que para estos genes, el valor de Ct debería ser similar a 20 (o incluso estar por debajo). Puede ser que estés añadiendo muy poco RNA a la reacción de síntesis de cDNA, por ello, revisa los cálculos para preparar este paso. Por otro lado, puedes correr tus muestras de RNA en un gel. En ese caso, deberías obtener dos bandas limpias y claras de los rRNA a 18S y 28S.
Nuestro consejo es aumentar el cDNA en la reacción de PCR o utilizar más RNA en el proceso de síntesis.
Un saludo
Tech Support
Labclinics
Carolina Gómez
Hola buenos días . Estamos intentando estudiar la expresión de un gen capsular en C. neoformans a diferentes tiempos empleando para ello el housekeeping gene 18S , y nos encontramos con el problema de que en la eficiencia se nos expresa muy tarde, pero lo que más nos preocupa es que a diferentes diluciones 1/10 la expresión ocurre de manera seguida y no a 3,3 ciclos entre cada dilución cómo debería ser. En un principio pensamos que era un fallo de dilución o de pipeteo, pero se reproduce constantemente. Alguna idea de dónde puede estar el fallo?
Pamela
Hola! nececitamos estudiar la expresión de 4 genes de defensa de plantas, más un gen de referencia de la planta. La cantidad de muestras es de 100. Qué tipo de sondas deberíamos utilizar y sugerencias nos brindarías?? Es la primera vez que vamos a realizar una RT-PCR.
María Isabel
Buenas noches, disculpe en mi PCR se me marca el blanco, que puedo hacer en este caso de contaminación.
Labclinics
Buenos días María Isabel,
Muchas gracias por contactar con nosotros. En principio tu PCR parece contaminada y la mejor opción es reemplazar los reactivos que constituyen tu protocolo por un nuevo lote.
Además, existen reactivos para descontaminar la poyata, micropipetas, etc. antes de empezar el protocolo. En este link puedes encontrar más información: https://www.labclinics.com/productos/pcr-cleandna-decontamination-spray-3/
Un saludo
Tech Support
Labclinics S.A.
Alejandro González
Buenos días, estoy estudiando biologia y en mi clase de Genética Molecular surgió una pregunta; ¿Porque en RT PCR aparecen productos de mayor tamaño? Puede que la respuesta no sea tan complicada pero no logró resolver esa duda pero les agradecería si pudieran ayudarme.
Muchas gracias de antemano